【无菌制剂】气化过氧化氢的灭菌技术及其验证分析

作者:陈琦 点击数:29 发布时间:2017-10-31
从空间消毒灭菌的定义入手,介绍了几种常见的消毒灭菌方法,详细阐述和比较了过氧化氢蒸汽灭菌技术、 过氧化氢干雾灭菌技术,并对气化过氧化氢灭菌器及其验证进行了探讨说明。
【无菌制剂】气化过氧化氢的灭菌技术及其验证分析

从空间消毒灭菌的定义入手,介绍了几种常见的消毒灭菌方法,详细阐述和比较了过氧化氢蒸汽灭菌技术、 过氧化氢干雾灭菌技术,并对气化过氧化氢灭菌器及其验证进行了探讨说明。

随着新版GMP的实施和推广,我国对无菌药品的生产提出了更高的要求。 灭菌一直以来都是无菌药品生产过程中的关键环节,为了提高产品的质量,选择合适的灭菌方式就显得尤为重要。在当前各种灭菌技术当中,气态过氧化氢(H2O2)灭菌被 公认为理想的灭菌方式。 气态过氧化氢灭菌方式正迅速成为用于制药、 生物和医疗卫生行业的生物净化的新选择,其对生物指示剂——嗜热脂肪芽孢杆菌能够达到106的杀灭率。

1.空间消毒灭菌

广义的空间消毒包括空间消毒和空间灭菌,是指能杀死一定空间内的病原微生物,但不一定能杀死细菌芽孢的方法,通常使用化学的方法来达 到 消毒的目的。用于消毒的化学药物叫做消毒剂。

空间灭菌是指把物体上所有的微生物(包括细菌芽孢在内)全部杀死的方法,通常用物理方法来达到灭菌的目的。

GMP(2010年修订)中规定的药品生产各级别洁净区内的空气悬浮粒子检测和微生物检测的标准如表1所示。

2.消毒灭菌方法

紫外线消毒

紫外线的杀菌能力随环境温度、 湿度、 风速等因素变化。在环境温度20 ℃、相对湿度40%~60%时,效果好;在环境温度0 ℃时,辐射能力低于60%,相对湿度>60%,辐射能力降低。另外,杀菌能力随使用时间的增加而降低,紫外灯的平均寿命为2 000 h左右。

紫外线可以杀灭多种微生物,包括细菌繁殖体、 芽胞、 病毒、 真菌、 支原体等,消毒使用的紫外线是200~275nm的C波紫外线,杀菌作用最强的波段处于250~270nm范围内。紫外线的杀菌效果与紫外线的辐射强度有直接关系,消毒使用的紫外线灭菌灯光源产生的辐射值必须能够达到国家标准(在电压220V、环境相对湿度60%、温度20 ℃时,紫外线强度不得低于70 μW/cm2)。为了获得满意的紫外线辐射强度,就需要对紫外灯的玻璃管、 反射罩和使用寿命提出相应要求。此外,紫外灯的辐射强度随照射距离的增加而减弱。

紫外线灭菌可能会对人体造成损伤,如直接照射在眼睛上,会引起结膜炎或角膜炎等。WHO和欧盟GMP规定:由于紫外线灭菌效果有限,不得替代化学消毒;最终灭菌环节不能使用紫外照射法灭菌。

甲醛熏蒸灭菌

对洁净室气体进行消毒的传统办法是将消毒液通过蒸发来熏蒸消毒,通常所用的消毒液有环氧乙烷、过氧乙酸、甲醛溶液等。以甲醛熏蒸灭菌为例,当湿度在65%左右、温度在24~40 ℃时,甲醛的消毒效果最好,其消毒灭菌原理主要是由于甲醛能破坏微生物的活性成分而达到消毒的目的。 通常将甲醛溶液倒入高锰酸钾中对洁净室的空气进行消毒,这主要是因为高锰酸钾遇到甲醛后会释放大量的热,使甲醛蒸发弥漫到空气当中。甲醛蒸汽具有强烈的刺激性气味,属于高毒性质物品,具有致癌性。

臭氧消毒

臭氧(O3)是有毒、淡蓝色、不稳定的极强氧化剂,相对气体密度为1.657。臭氧是一种广谱高效消毒剂,具有强烈的杀菌消毒作用。臭氧在常温下不稳定,极易分解成氧分子与氧原子,氧原子具有氧化性,能破坏微生物的细胞膜从而将其杀死,其多余的氧原子会自动结合成氧分子,不会产生有毒的残留物。产生臭氧的原料是氧气与电能,通常由臭氧发生器产生臭氧。

臭氧属于有害气体,当浓度为6.25×10-6 mol/L(0.3mg/L)时,眼、鼻、喉有刺激的感觉;当浓度为(6.25~62.5)×10-5 mol/L(3~30mg/L)时,会出现头疼及呼吸器官局部麻痹等症状;当臭氧浓度为3.125×10-4~1.25×10-3 mol/L (15~60 mg/L)时,则对人体有危害。

气态过氧化氢灭菌

过氧化氢(双氧水)自身是一种消毒剂,从过氧化氢的分子式中就可以完全免除有毒或有害的嫌疑,并且灭菌过程低温、 低湿、 快速,完全符合未来灭菌设备的发展方向。 过氧化氢是一种高密度的氧化剂,具有放热分解成水蒸气和氧的特性。过氧化氢主要通过氧化作用灭菌,且分解后无残留毒性。气态过氧化氢(H2O2)灭菌分为过氧化氢蒸汽(HPV)灭菌技术和过氧化氢干雾(VHP)灭菌技术两种。

3.过氧化氢蒸汽 ( HPV) 灭菌技术

过氧化氢蒸汽 ( HPV) 灭菌技术的原理

过氧化氢蒸汽灭菌采用双循环技术,结合PLC程控将灭菌循环的效果最佳化,当过氧化氢在房间或舱体的表面消毒灭菌时,将一层均匀的 “微凝结”过氧化氢分布到所有表面,可以将 “微凝结” 视为一个肉眼看不到的H2O2的微薄膜。这个阶段可以在显微镜下看到一个肉眼不可见的亚微米级的过氧化氢薄层,科学研究证实,这个低温、 无残留的过程已经在蒸汽发生阶段就开始杀灭微生物。 过氧化氢通过复杂的化学反应解离具有高活性的羟基,破坏细胞膜。微冷凝的形成确保了微生物杀灭的最佳条件,当达到凝露点时,杀死90%微生物的数量所用的时间最短。 从灭菌动力学曲线可以看到微生物的数量陡降,伴随着微冷凝的形成,生物指示剂数量曲线从舒缓变得急剧下降。

过氧化氢蒸汽 ( HPV) 的灭菌工艺

调节

对空气的相对湿度进行调整,并提高空气温度。

梯度气体注入

过氧化氢气体持续注入到空气流中,使得过氧

化氢浓度迅速上升。

保持气体注入

维持净化所需的过氧化氢气体的浓度。

通风

停止过氧化氢气体的注入,将环境内的空气进行置换,通过裂解剂裂解过氧化氢,最终使过氧化氢全部排出。

4.过氧化氢干雾 ( VHP) 灭菌技术

过氧化氢干雾灭菌又称气化过氧化氢 ,即Vaporized Hydrogen Peroxide,VHP。过氧化氢干雾灭菌法是利用物理手段将液体转变成气溶胶状态的干雾,让其弥散在需要灭菌的空间。过氧化氢在常温下的气体状态比液体状态具有更强的杀孢子能力,经生成游离的氢氧基,用于进攻细胞成分,包括脂类、蛋白质和DNA,达到完全灭菌的要求。 其常用于冻干机、隔离器、房间、RABS、灌装线以及不同配置的操作/生产领域等密闭空间的灭菌。

过氧化氢干雾 ( VHP) 灭菌的原理

过氧化氢因具有氧化还原作用而具有杀菌效果,特别对厌氧芽孢杆菌的杀灭效果最好。过氧化氢的作用原理是通过复杂的化学反应解离具有高活性的羟基,用于攻击细胞的成分,包括破坏细胞膜、 脂类、 蛋白质和DNA。 通过 “闪蒸” 将液态H2O2转化为过氧化氢干雾,此过程可在常温常湿的环境下有效进行,不需要进行除湿等特别的预处理。过氧化氢干雾被均匀地引入密闭空间,其内表面完全暴露于过氧化氢干雾中,形成约1 μm的过氧化氢膜,附着在可能寄居了微生物的表面,微生物自身会作为核心被形成的微冷凝所包裹,并迅速在此过程中被杀灭。

根据消毒技术规范要求,灭菌的目标定为生物指示剂(BIS)达到106的杀灭率,通常使用的生物指示剂(BIS)为黑色枯草芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌。 完成消毒后的过氧化氢干雾(VHP)被催化分解为水蒸气和氧气,也可以使用强力通风装置对其完全分解,或者使用建筑空调通风系统,对冻干机来说可以借用其抽真空系统迅速去除残留的过氧化氢干雾。

过氧化氢干雾具有很好的杀灭细菌芽孢的作用,作为一种消毒灭菌介质,浓度为35%的双氧水通过过氧化氢干雾(VHP)发生器汽化,对被灭菌物进行消毒灭菌。实验证明,过氧化氢干雾的杀灭细菌芽孢的能力强于同数量级的液态双氧水, 750~2 000 μg/L浓度的过氧化氢干雾的灭菌效果等同于300 000 mg/L浓度的液态双氧水。低浓度灭菌也相应降低了被消毒表面的材质要求与成本。 过氧化氢干雾灭菌操作的温度范围可以适应在4~80 ℃之间,一般室温即可。 在消毒灭菌过程中,过氧化氢干雾被还原成水与氧气,与其他灭菌方式相比,没有危害性的残留物,对操作人员及环境无危害。

过氧化氢干雾 ( VHP) 灭菌技术的特性

特点

(1)消毒灭菌可以在室温条件下进行;

(2)消毒周期短,过氧化氢干雾的消毒周期只需5~7 h,而蒸汽消毒周期为8~10 h,环氧乙烷气体消毒灭菌周期为12~18 h;

(3)过氧化氢干雾消毒灭菌对操作人员无危害,对环境无污染,其最终残留物为水和氧气;

(4)蒸汽灭菌使腔室产生很大的压差变化,长期反复受压、抽真空,会缩短设备的使用寿命,而采用过氧化氢干雾灭菌,因压力、温度条件的改善,使设备的运行寿命和维修周期得以延长;

(5)长期使用蒸汽灭菌,湿热气体易破坏腔体内表面的不锈钢钝化膜,而过氧化氢干雾灭菌则很少损害腔体内表面的不锈钢钝化膜;

(6)采用移动式(带脚轮)的过氧化氢干雾(VHP)发生器,能对多台设备配套灭菌,减少设备的初投资费用;

(7)过氧化氢干雾菌的工艺重复性好,较易通过验证测试;

(8)对高效过滤器HEPA的穿透性好(玻璃纤维);

(9)对于其他物品无影响,如装置、 电器、洁净室墙板等。

优点

低温、快捷,适用于不耐高温、湿热的器械,被灭菌材料和物品的范围广,对器械损耗少,有完善的监测系统。

缺点

(1)人体接触过多的过氧化氢可致皮炎、支气管或肺脏疾病,经口中毒时会出现腹痛、胸口痛、呼吸困难、呕吐、体温升高、结膜和皮肤出血症状,个别出现视力障碍、痉挛、轻瘫;

(2)不能用于处理植物纤维素制品,如棉布、 亚麻布和纸;不能用于处理尼龙和聚酯纤维和活体;不能用于处理长40 cm以上、 直径3 mm以下或有盲管、 尖角的器械;不能用于处理有机物与无机物污染以及先灭菌后清洗的器械。

过氧化氢干雾灭菌工艺

除湿

将空气的相对湿度减少至参数设置点,使空气可以作为过氧化氢气体的载体,并在净化阶段维持过氧化氢气体的浓度在饱和露点水平之上。

调节

过氧化氢气体持续注入到干燥的空气流中,置换灭菌目标环境中的空气,使得过氧化氢浓度迅速上升。

净化

维持净化所需的过氧化氢气体的浓度。

通风

停止过氧化氢气体注入,对环境内的空气进行置换,通过裂解剂裂解过氧化氢,最终使过氧化氢全部排出。

5.过氧化氢蒸汽 (HPV)和过氧化氢干雾(VHP)灭菌技术的比较

过氧化氢蒸汽(HPV)过氧化氢干雾(VHP)灭菌技术的比较如表2所示。过氧化氢干雾消毒灭菌作为最为安全、稳妥的过氧化氢灭菌方式,受限于严苛的工艺要求,相对湿法灭菌需要冗长的灭菌周期,一直被湿法工艺的拥护者们指责。湿法(微冷凝)工艺依据 “必须要有一定的湿度才能达到和保证灭菌效果”的理论,但研究早已证明干法灭菌的效果丝毫不逊于湿法。

6.干法气化过氧化氢(DVHP)灭菌技术

干法气化过氧化氢(DVHP)灭菌是一种改良的干法工艺,既具备干法过氧化氢灭菌的优点,又具备微冷凝法所有的便利。

(1)均匀分布的过氧化氢气体浓度更低,且可以进行矩阵式监控;

(2)全程高速除湿,保证周期内不会出现冷凝现象;

(3)对于环境的要求不高,选配的附件满足各种应用需求;

(4)灭菌速度更快,EHS保证更高,灭菌的效果可以重现。

7.气化过氧化氢灭菌器

气化过氧化氢灭菌器是经专门设计制造而成的一种用于气闸间、隔离器、传递舱、混粉机、离心机、冻干机、原料药密闭式(c-RABS)分装、小型洁净室等密闭空间灭菌的专用设备,亦可用于灌装线RABS的在线灭菌。气化过氧化氢灭菌器将 干法气化过氧化氢(DVHP)发生器、蒸汽喷射和通风单元整合为一个移动系统,用户通过触摸屏进行本地或远程无线操作。

气化过氧化氢灭菌器的特点

(1)快速、 自动的房间/区域灭菌,最大灭菌空间高达300m3;

(2)可移动系统,灵活机动,可轻松转移到需要灭菌的区域;

(3)一体化可拆卸底座,控制单元和无线数据影音传输可实现远程操作、 监控;

(4)广谱杀菌,灭菌水平高;

(5)低温生物净化过程,自循环过氧化氢降解分解单元;

(6)良好的材料兼容性,包括敏感电子元器件、仪器仪表;

(7)双回路技术可快速有效地进行生物灭菌循环,过氧化氢消耗低;

(8)内置过氧化氢分解媒,多余的过氧化氢可分解为水和氧气,整体达到无残留;

(9)全部数据可打印记录,大容量的历史记录存储。

灭菌循环的4个阶段

准备阶段

对蒸发器、 管道和腔体进行预热,防止过氧化氢气体冷凝。

汽化阶段

过氧化氢溶液滴落到蒸发器后,形成气化过氧化氢,喷射入灭菌空间内,直至达到饱和状态,此状态对微生物有最好的杀灭效果。

维持阶段

不断会有气化过氧化氢被喷射入空间内,维持气化过氧化氢的饱和状态,以实现对灭菌表面的持续覆盖和对微生物的持续杀灭。

通风阶段

灭菌空间内的气化过氧化氢通过催化过滤器被分解为氧气和水蒸气,也可采用辅助通风设备将蒸汽排出传递舱外,直至监测到的过氧化氢浓度低于1 ppm。

8.气化过氧化氢灭菌器的验证

设备工艺或性能要求

(1)喷雾颗粒平均小于10 μm,可提供粒径证明;

(2)过氧化氢灭菌系统的灭菌效果应不低于传统的甲醛熏蒸效果,对黑色枯草芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌孢子生物指示剂可以达到106的杀灭率,即下降6个对数单位;

(3)可提供灭菌气体的证明材料,对洁净室及设备的相容性说明应包括:金属(主要是不锈钢、铝合金、铜等) 、工程塑料、橡 胶、洁净室墙板顶板、PVC地面、环氧树脂自流平地面、高效送风口、回风口、有机玻璃、插座、开关、电话、现场显示仪表等;

(4)喷干雾装置在喷干雾时必须能保证喷出的干雾能均匀扩散到房间各个部位,没有局部分布不均匀或设备漏液现象;

(5)环境温度:(22±2)℃,环境湿度:45%~55%;

(6)设备配置可远程无线遥控器,使灭菌过程实现无人值守(提高效率、方便实用);

(7)设备表面及所有部件应便于清洁,不能有清洁死角,外表面均抛光光滑,符合卫生要求;

(8)应有相关的验证支撑确保灭菌以后的灭菌剂残留不会与药品直接接触,不会对药品构成任何形式的污染;

(9)在设备有故障或失效的情况下,元件必须包含必要的保护装置,以确保设备和物品保持在一个安全的状态。

安全要求确认

(1)设备上易对操作人员造成伤害的运动部位应有安全罩;

(2)设备任何部位不能有锋利的边缘和尖角;

(3)易于接近人体的区域安装紧急停止按钮,以减少人机工程伤害;

(4)断电时,机器逐渐停稳,以保护操作人员、设备和产品的安全;

(5)恢复供电后机器不能自动开机,必须人工启动;

(6 )电气系统的安全性能应符合相应的国家标准。

电力及控制系统确认

(1)所有线缆均有标号并有连接线路图;

(2)设备具有接地线;

(3)所有电缆终端应卷曲包好线头做好相应标记;

(4)所有控制配线必须采用低电压控制系统;

(5) 系统应具有诊断功能以识别和阐述故障,显示导致设备停机的故障;

(6)有良好的人机界面,操作安全可靠,可显示设备主要运行参数。

运行确认

安装结束后,对过氧化氢系统进行调试运行,电源开关和启动按钮是否能正常打开,液体喷射是否正常。

启动按钮工作状态确认

连接电源线,打开电源开关,按下启动按钮,记录电源开关指示灯状态,记录按下启动按钮倒计时。15 s后的设备运行状况,测定3次。

可接受标准:设备连接电源后打开电源开关,电源开关指示灯亮。按下启动按钮后,设备发出15 s蜂鸣声之后开始运行。

单位时间喷嘴喷雾流量及残液量测试

按照设计要求,设备开始喷射后,其喷射量为1 000 mL/h

(1)测试方法:在杀孢子剂卡位上,用专用的杀孢子剂瓶放置一瓶1 000 mL的纯水,连接电源,调节喷射量到1 000 mL位置,开始喷雾,同时记录开始时间,当喷嘴不再喷雾时再记录时间,关闭电源,取下杀孢子剂专用瓶,用经校准后的量筒计量罐内残液量。 重复上述过程2次,每次杀孢子剂专用瓶中分别放置500 mL和750 mL的纯水。

(2)喷嘴喷雾流量计算:喷雾流量= (加液量-残液量)/喷雾时间。

(3)可接受标准:喷雾流量:连接电源开始工作时的喷雾流量应达到1 000 mL/h;残液量:0。

性能确认

过氧化氢灭菌效果的要求

灭菌是指杀灭细菌及其细菌繁殖体、 芽孢、 病毒和真菌孢子等一切形式的微生物的过程。 国际上为了量化无菌的标准,提出了无菌保证水平的概念,并以此来评价灭菌的杀灭效果。我国及欧美药典都将 “无菌保证水平值不大于百万分之一” 作为最终灭菌产品的无菌保证要求。

气化过氧化氢灭菌设备的位置确定

气化过氧化氢灭菌设备喷头的喷射方向与水平呈45°,干雾被喷射出来的初始速度非常快,由于自身的惯性作用,干雾离开喷头的一小段距离整体呈弧线运动,惯性作用消失后干雾在空间中作无规则的布朗运动,弥漫扩散到相对密闭空间的每一个角落。 但是,由于不同的企业洁净区有不同的布局,在一定环境条件下,空间的布局直接影响到了干雾扩散的快慢。 为了快速达到整个洁净区扩散完全混合均匀的最佳状态,取得较好的灭菌效果,务必对设备的台数及位置进行全面的考虑和精确的摆放。

设备摆放位置应遵循以下原则:

(1)优先满足核心区域;

(2)喷嘴远离墙壁和设备,避免遮挡喷雾;

(3)以易于干雾扩散的位置为佳。

消毒效果确认

1、实验条件

(1)实验菌株:枯草杆菌黑色变种(ATCC9372)芽孢,抗力鉴定合格;嗜热脂肪杆菌(ATCC7953)芽孢,抗力鉴定合格。

(2)染菌载体:不锈钢片、钢针、聚四氟乙烯片等,载体回收菌量为1×106~5×106 cfu/载体。

(3)培养基:

胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA):胰蛋白胨1.5 g/100 mL;大豆蛋白胨0.5 g/100 mL;氯化钠0.5 g/100 mL;琼脂1.6 g/100 mL。用蒸馏水配制而成,调节pH为7.2±0.2,经过121 ℃压力蒸汽灭菌后使用。

胰蛋白胨大豆肉汤培养基( TSB):胰蛋白胨1.5 g/100 mL;大豆蛋白胨0.5 g/100 mL;氯化钠0.5 g/100 mL。 用蒸馏水配制而成,调节pH为7.2±0.2,经过121 ℃的压力蒸汽灭菌后使用。溴甲酚紫蛋白胨培养液:蛋白胨10 g;葡萄糖7.5 g;蔗糖2.0 g;可溶性淀粉1.5 g;1%溴甲酚紫乙醇溶液1.3 mL;蒸馏水1 000 mL。将蛋白胨、 葡萄糖、 蔗糖溶解于蒸馏水中,调节pH至7.2~7.4,加入1%溴甲酚紫乙醇溶液,摇匀后,每管分装5 mL,于115 ℃ 压力蒸汽灭菌30 min,置于4 ℃冰箱备用。

(4)中和剂:0.1%的硫代硫酸钠。

(5)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基。

(6)磷酸盐缓冲液0.03 mol/L,pH为7.2。

(7)模拟医疗器械管腔:材质、 内径和长短应与最难灭菌的消毒对象相一致。

(8)不锈钢管腔:内径约为1.2~1.5 cm,长度为3.0~5.0 cm,两端有接口,可与模拟医疗器械管腔连接,不锈钢管腔的内体积应小于或等于模拟医疗器械管腔的内体积,管腔一端应有可密封的接口便于放置染菌载体。

2、布点选择

选择工艺关键房间,离干雾灭菌设备较远点,作为消毒效果确认点

3、灭菌效果测定操作程序

(1)将染菌载体放入模拟医疗器械管腔的中间位置或不锈钢管腔内,两端分别连接模拟医疗器械管腔,置于专用灭菌包装袋内;

(2)加入规定量及规格的过氧化氢,并启动该灭菌程序,进行灭菌处理试验;

(3)灭菌程序结束后,在无菌条件下取出染菌载体,将枯草杆菌黑色变种芽孢载体放入含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)培养液, 37 ℃培养,将嗜热脂肪杆菌芽孢载体放入溴甲酚紫蛋白胨培养液, 56 ℃培养,作为试验组;

(4)将同批试验用的2个枯草杆菌黑色变种芽孢载体分别放入含5.0 mL稀释液试管中,各振打200次;将同批试验用的2个嗜热脂肪杆菌芽孢载体分别放入含5.0 mL稀释液试管中,各振打200次,进行活菌培养计数,作为菌数对照组;

(5)将同批试验用的2个枯草杆菌黑色变种芽孢载体放入含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)培养液, 37 ℃培养;将同批试验用的2个嗜热脂肪杆菌芽孢载体放入溴甲酚紫蛋白胨培养液,56 ℃培养,作为阳性对照组;

(6)将同批试验用的2个未染菌载体放入含中和剂的TSB培养液,37 ℃培养,2个未染菌载体放入溴甲酚紫蛋白胨培养液,56 ℃培养,作为阴性对照组;

(7)上述试验重复5次。

4、评价规定

灭菌合格标准:每次试验的菌数对照组回收菌量均为1×106~5×106 cfu/载体;阳性对照组有菌生长;阴性对照组无菌生长;试验组无菌生长。

结语

当前在对药品日益严格的质量诉求下,寻求规范的灭菌工艺、 科学的验证手段已成为制药领域的当务之急。过氧化氢灭菌作为一种新兴的灭菌技术,因其具有无毒副残留、 快速、 易于验证、 可靠安全等优点,越来越被国内外制药界及生物技术领域所认同与应用。

作者:陈琦,南京白敬宇制药有限责任公司

来源:机电信息

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