皂苷类有效成分的快速高效分析--利用ASE和HPLC快速高效地分析皂苷类有效成分

作者:本网编辑 文章来源:《流程工业》(制药) 发布时间:2010-07-05

戴安公司(DIONEX)的加速溶剂萃取仪(ASE)和高效液相色谱仪为人参、西洋参和三七等药材中皂苷类有效成分的提取、分离及药材的鉴别提供了一个快速、自动且高效完整的解决方案。

五加科人参属植物人参、西洋参和三七均为名贵药材,广泛应用于临床。人参性平,味甘微苦,具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津安神、益智等功效;西洋参性凉、味甘微苦,功能以补气养阴,散热生津为主,可滋阴降火;三七性温,味甘微苦,可散瘀止血,消肿定痛。这三种药材均具有多方面的药理和生物活性,含有多种类型的化学有效成分,如皂苷类、多糖类、多肽类、脂肪酸、氨基酸等,其主要活性成分为中极性部分的皂苷类成分。

目前,人们已经从人参(白参、红参)及其地上部分得到了近40种人参皂苷,一般将总皂苷称为人参皂苷Rx,按硅胶薄层色谱Rf值的大小顺序,由小到大命名为Ro、Ra、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、Rh2、Rh3 … …。

根据苷元的结构分为A、B、C三类(图1),A型和B型人参皂苷结构母核为四环三萜达马烷型,是达马烯二醇的衍生物,二者C20的构型均为S型。A型人参皂苷的苷元为20(S)-原人参二醇,B型人参皂苷的苷元为20(S)-原人参三醇。C型人参皂苷结构母核为五环三萜齐墩果烷型。


                                  

图1  苷元的结构分为A、B、C三类。

ASE(快速溶剂萃取仪)

目前这三种药材的活性成分大多是采用传统的萃取-净化-浓缩提取方法,中间过程复杂繁琐,损失大且效率不高。采用戴安公司的ASE(快速溶剂萃取仪),通过提高温度,使用尽可能少的溶剂,可在尽可能短的时间完成萃取过程,在20min内完成对多种参类样品目标分析物的自动快速提取。与传统的提取方法相比,其具有耗时短、步骤少和效率高等特点,而且所得的多数样品溶液基本无需净化处理,可直接在液相色谱仪上进样分析。

ASE是一种使用很少量的液体溶剂或溶剂混合物,通过升高温度和压力,在很短的时间内完成对固体或半固体样品萃取的一种提取方法,已得到广泛应用。它把传统的萃取时间从以天或小时为单位计算降低到仅用几十分钟, 甚至十几分钟,可以在无人值守的状态下自动连续萃取,大大提高了实验室工作效率;另外,ASE是一个全封闭系统,保证了操作人员的健康和安全。此方法可与传统索氏提取、超声和振摇萃取等方法兼容。

样品的提取方法

样品准备:分别将2g人参、西洋参和三七样品磨成粉末状与硅藻土混合后装入5ml的ASE萃取池。也可在ASE萃取池底部铺上一层氧化铝,来吸附色素、脂类等杂质,使色谱的干扰峰减少,但需要进一步的条件优化,以免皂苷类目标分析物也被吸附。

仪器:ASE 200型加速溶剂提取仪。

ASE条件:140℃温度;甲醇静态萃取5min;循环2次。

液相色谱的分离方法

Dionex UltiMate 3000高效液相色谱系统,包括在线脱气机(SRD3400),高压四元梯度泵(HPG3400),自动进样器(WPS3000TSL),柱温箱(TCC3000)和紫外检测器(VWD3400)。色谱柱为Acclaim 120 C18色谱柱(4.6 × 250 mm,5μm)。色谱条件:柱温50℃;检测波长203 nm;乙腈水梯度洗脱。

结果与讨论

2g样品的 ASE提取液大约有25ml左右,定容至40ml后可直接用于分析。即使不用浓缩步骤,也可以得到很高的色谱峰,这说明ASE的提取效率相对于其他技术有明显提高。

现有方法通常利用高效液相色谱对皂苷类成分进行分析,大多耗时极长。例如2005版中国药典中,分离三七样品的梯度是60min,而分离人参和西洋参样品的梯度均长达100min。戴安公司的UltiMate 3000高效液相色谱仪用同样的ASE提取手段及色谱方法,在反相C18色谱柱上仅用25min即分别完成三种不同药材(人参、西洋参和三七)中15种主要皂苷类物质的分离,大大缩短了分离时间,同时也显著降低了溶剂消耗。

使用高效液相色谱并采用紫外末端203 nm作为检测波长,是最为广泛的皂苷类的测定方法。相对于2005版药典的规定方法,本方法只需简单地改变梯度和柱温。

 

图2  15种常见皂苷类标样的分离色谱图

 

图3  人参样品的色谱图


 

图4  西洋参样品的色谱图

 

图5  三七样品的色谱图


图2为在前述色谱条件下25min梯度内对15种常见皂苷类标样的分离。它们包括人参皂苷:Re(2)、Rg1(3)、Rf(4)、Rb1(5)、Rc(6)、Rg2(7)、Rb2(8)、Rb3(9)、Rh1(10)、Rd(11)、Rg3(12)和Rh2(14);皂苷元:原人参二醇(15)、原人参三醇(13);三七皂苷R1(1)。

Re与Rg1是重要的人参皂苷,结构极为相似,是较难分离的两个皂苷。试验表明,在Acclaim 120 C18色谱柱上,随着温度的升高,Re与Rg1分离度增大。因此,柱温选定为50℃。

图3~图5分别为人参、西洋参和三七药材样品的色谱图。图上标出了2005版药典要求的人参皂苷Re、Rg1、Rb1及各自的特征皂苷。人参皂苷Rf (图2)是人参区别于西洋参的特有皂苷;另外,也可根据人参皂苷Re和Rg1的比例来区分人参,西洋参和三七:人参中Re:Rg1≈1:2,西洋参中Re:Rg1≈10:1,三七中Re:Rg1≈1:10。三七皂苷R1是三七的特有皂苷 (图5)。

另外,也可以利用本方法制作快速、简单、可信度高的人参、西洋参和三七的指纹图谱,用来鉴别药材质量的好坏,以及不同批次、产地和收集时间的药材的质量差异。

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